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昨天晚上在上一期的Reptilia上看到了這篇有關於陸龜飼養的文章, 覺得寫得很不錯,
於是就花了一點時間將之翻成中文和大家分享
本人因為工作的關係, 無法每天照顧我所飼養的爬蟲, 所以我只養蛇類, 而沒有養任何的陸龜
因此, 如果在翻譯上有任何的錯誤, 還請大家見諒
本篇文章在介紹如何診斷的部份包含了一些簡單的分生和病毒學的技術和觀念
因為時間的關係, 本人並沒有對這些技術做任何的解釋,
如果真的有興趣的朋友可以自行查閱一些分子生物相關的書籍或網路上的資料
不過, 就算您跳過這些技術性的部分也沒有關係,
因為看完本篇文章後, 最重要的就是要了解皰疹病毒對陸龜所產生的危害以及如何去預防病毒的感染
最後, 希望大家的陸龜都能健康的成長 ^^
ps. 我並不知道國內是否有獸醫院有提供文章中所提到的檢疫技術
原文出於Fischer S., and Homuth M., 2006. Herpesvirus Invection in Tortoises Illness, Diagnosis, and Prevention. Reptilia No. 47:78-82.
陸龜一直以來都是一種很受歡迎的寵物。大多數的陸龜的飼主都對這個特別的興趣下了不少功夫 — 他們通常投入大量的時間、金錢及愛心，且熱切得想要去了解如何才能提供他們的寵物最好的生活環境。不過，除了擁有飼育陸龜的知識之外，飼主也應對於陸龜的健康維護有基礎的了解。如次一來，飼主才能即時地發現陸龜的疾病，並做立即的處治，甚至更進一步的預防疾病的發生。皰疹病毒的感染在陸龜中是很普遍的，且不斷的造成陸龜的折損。所以每一個飼主都應對此疾病有所了解。
病症
皰疹病毒對於陸龜感染的案例，最早被報告於1980年代的早期，其對像為沙漠陸龜(desert tortoise, Gopherus agassizii)。從那時候起，皰疹病毒感染的案例也在許多在歐洲普遍被飼養的陸龜種類上被發現--包括蘇聯四趾陸龜(Russian four-toed tortoise, Agrionemys horsfieldii)、赫曼陸龜(Hermann’s tortoise, Tesudo hermanni)、地中海刺腿陸龜(Mediterranean spur-thighed tortoise, Testudo graeca)以及緣翹陸龜(marginated tortoise, Testudo marginata)。
陸龜被皰疹病毒感染的點型特徵為口腔黏膜的發炎及壞死(壞死性口腔炎/necrotic stomatitis)，而口腔中通常也會產生似白喉的斑點。此外，鼻子(鼻炎)及眼睛(結膜炎)的黏膜、咽頭(咽頭炎)、舌頭(舌炎)或肺部(肺炎)也可能會有發炎的現象。其他的器官，如腸道、肝、皮膚、腦膜及腦也都有可能因皰疹病毒的感染而發炎。
被皰疹病毒所感染的陸龜會因被感染部位的不同而表現出各種不同的症狀。概略症狀包含活動力減低、食欲下降、鼻孔阻塞或流鼻涕、瀉肚子、中央神經系統失調及突發性的死亡。一般來說，被皰疹病毒感染的陸龜死亡率都很高。
感染後症狀的發展及表現以及致死率會依病毒品系、陸龜種類、陸龜年齡以及個別陸龜免疫系統狀況(特別有關)的不同而異。被皰疹病毒所感染的蘇聯四趾陸龜和赫曼陸龜死亡率通常很高，但被感染的地中海刺腿陸龜或馬吉那提陸龜大多能存活下來，且成為無病症的帶原者。
病源：特性及傳播方式
皰疹病毒(Herpesviridae科)的直徑大約為120~200奈米(nanometer)，或是0.00012~0.0002公釐(細菌(如鏈球菌)的體形大概是他們的十倍)。皰疹病毒是由中心核酸(雙股DNA)以及外鞘蛋白所組成的。除了他們的外鞘蛋白外，皰疹病毒對於不合適的環境或是清潔劑的容忍度很低。用一般的家用消毒劑就可能輕易的將他們殺死(譯者：漂白水是不錯的選擇)。
皰疹病毒的寄主十分廣泛，且在動物界中造成許多的疾病(例如感染狗所造成的犬瘟熱)。會感染陸龜的品系是一種和alpha-皰疹病毒相近的非點型皰疹病毒。因此，我們推測這個品系的病毒會像alpha-皰疹病毒一樣，存留於陸龜的神經節之中，造成終生、慢性的感染。
陸龜的免疫系通可能會因冬眠、不良的飼育環境、寄生蟲感染、遷移或更換飼主所造成的緊迫(不同的照顧和餵食方式)或更換飼育環境(硬體設施)而減弱，而這又會導致病毒活動力的上昇。此時，病毒會隨著身體的分泌物而散佈，且造成疾病。
皰疹病毒會隨著陸龜的唾液、鼻涕或尿液而傳播。感染的途徑包括直接接觸或是間接的經由其他的物品，例如工具，鞋子或飼養容器等。皰疹病毒也被發現存在於陸龜的輸精管上皮細胞中，因此，病毒也可能會藉由交配而傳播。交配期間個體之間的直接接觸使得感染的機率大為增加。
診斷
1.病毒檢測法(直接病原檢測法)
在活體動物中，皰疹病毒只有在其活化且被分泌時，才能直接被檢測出來。此時，動物體可能已經出現病症，或者看起來仍然很健康。
病毒的培養是很耗時的工作(大約需要7~21天)，而病毒培養的成功率主要取決於樣本(如舌頭的上皮細胞)的新鮮度以及樣本內仍具有複製活性的病毒數量。另外，如果樣本內細胞的數量夠多的話，我們可能可以用光學顯微鏡來檢測細胞內的包含體(inclusion bodies)。
檢測病毒最佳也是最快速的方法就是利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain rection / PCR)來偵測感染龜類的皰疹病毒的DNA。這個技術可以快速的將皰疹病毒的DNA片段放大(超過百萬倍)，而放大的DNA片段可以利用ethydium bromide染色而觀查到(譯者：對PCR, electrophoresis是大多數分生實驗室都會利用到的小技術，有興趣的爬有可以輕易的在網路上找到他們的原理，在此就不再贅述了)。利用此技術來檢驗樣本，不同於病毒培養，樣本內的毒病不需要保有複製的活性。因此，PCR已成為現今用來檢測皰疹病毒最精確的方法了。
皰疹病毒的DNA中含有能控制病毒構造以及病毒在陸龜體內細胞中複製的所有資訊。其中的DNA polymerase和DNA-helicase等基因都是PCR反應很好的目標基因(譯者：有興趣的朋友可以去查分生相關書籍中有關於DNA複製的部份)。這些基因在許多不同的PCR技術中都可被利用作為目標。我們可以利用不同的PCR方法來檢測不同品系的皰疹病毒。目前例行性的檢測，如同VAN DEVANTER等人在1996年所做的報告，是利用pan-herpes consensus primer PCR來檢測並分析多種類的皰疹病毒。利用這個方法，我們可以檢測出由6種不同種類陸龜內所採樣的35種皰疹病毒的品系。
另一個方法是利用PCR去檢測皰疹病毒DNA-helicase基因上的DNA續列。不過這個方法只能作輔助性的診斷用，因為這個方法無法檢測出皰疹病毒所有的品系。
如果被感染的動物死亡的話，我們也可以靠著檢測細胞內的包含體或是病毒顆粒來診斷皰疹病毒的存在。不過，在這個時候，我們還是會選擇利用PCR來檢測，因為他既快速又可靠。
2.抗體檢測法 (非直接病源檢測法)
利用病毒中和測試 (virus neutralization test / VNT)來檢測血漿中的病毒已經是一種例行性工作了。毒病的特性是他們會選擇性的進入特定種類的細胞中，而在這些細胞內，他們會進行複製。假如陸龜的血漿中有產生抗皰疹病毒的抗體，抗體就會和皰疹病毒結合而將之中和，進而防止病毒進入細胞。在病毒中活測試中，我們將採自陸龜體的血清經過不同倍數的稀釋(如1：2、1：4等)，並配合已知的皰疹病毒品系以及此病毒可感染的細胞來估算出陸龜血液特定抗體的濃度。
另一種方法是利用ELISA的技術，這個方法是利用酵素反應來檢測特定抗體的的存在(譯者：有興趣了解的朋友也請自行到網路上查詢ELISA的原理)。
因為陸龜在受皰疹病毒感染後,要經過一段間後才會產生抗體。因此，VNT的技術至少要在病毒感染後的11週才能診斷出病毒的存在。而相對之下敏感度比較高的ELISA也至少要在病毒感染後6週才能做檢測。
病例報告
本病例是描敍一位普通的陸龜飼養者，因忽略對皰疹病毒的預防而造成其陸龜發病死亡，以及我們所選用的診斷方法。本病例中清楚可見的危險因子如下：由不可靠的來源取得動物(我們應該避免這麼做，以確保其他動物的健康)、不適當的隔離觀察以及不能即時的檢測出皰疹病毒的感染。
1.物種的取得以及其病症
根據飼主的說法，他在2004年的夏天，從Usedom島(位於德國和波蘭交界的波羅的海上)上的波蘭市場購得一隻看起來很健康，年齡約在1~2歲的母蘇聯四趾陸龜(Agrionemys horsfieldii)。回家後，他發現這隻陸龜有蟯蟲，因此他就將這隻陸龜帶到給獸醫驅蟲。之後，他將新買的母龜隔離觀察4星期後(時間太短了)，將其和另一隻同種的公陸龜飼養在一起。
在冬天的時候，飼主將兩隻陸龜分別放在鞋盒中，並將鞋盒置於地下室4個月讓他們冬眠。在隔年的春天(2005年)，冬眠結束後，母龜的左眼一直沒有睜開，在其右眼睜開後幾個小時依然如此。因此，飼主又將其隔離觀察。此時，母龜並沒有發炎或是流鼻水的現象。
兩隻陸龜在冬眠後都立刻恢復進食。不過，新買來的母龜看起來沒有什麼活力，且在接下來的幾天，情況持續的惡化。首先，他的鼻孔變的阻礙，且有時會隨著呼吸發出咻咻的聲音。將之浸泡在微溫的水中時及剛泡水之後，他會張大嘴巴來呼吸。在症狀發生一個星期之後，他的前肢在常用來走路及挖洞的區域開始產生發炎及硬化的現象。和其他案例不同的是，這隻母龜的口腔黏膜沒有發炎的現象，也沒有斑塊(plaque)的產生。以上這些症狀以及他們所發生的時機，都指向這可能是皰疹病毒感染的案例。
為了要証實這個推測，我們利用乾的紗布小心地自病龜的咽喉處採樣。我們謹慎地確認紗布跟病龜的舌頭和口腔黏膜都有確實接觸。之後我們將用來採樣的紗布保存在5℃的暗處直到檢測為止。我們也從病龜前肢的發炎硬化處採取血液及深層皮膚的樣本。
為了要檢測病龜體內的細菌群落以及篩選可用之抗生素以利之後可能發現為細菌感染時的處治，我們再一次自病龜的咽喉處做採樣。這次是利用沾有細菌轉移培養基(transport medium)的紗布做採樣。此外，我們也採集病龜的尿液以利之後的診斷分析。
在冬眠結束後的第十天，病龜因嚴重的呼吸困難而死亡。我們將病龜的腹甲及背甲分離，並將內部的器官取出做進一步的分析。
2.分子生物學以及病毒學的分析
我們自所有採得的樣品(咽喉、血夜、皮膚以及尿液樣本)中萃取出DNA，並利用PCR做分析。在所有分析的的過程中，我們都很謹慎，防止從樣本中所萃取的DNA被外界的DNA所污染，以確保檢測結果的精確。
我們利用pan-herpes consensus primer PCR的技術來放大自咽喉、血液、皮膚、尿液以及各個器官所採集的樣本內的龜類皰疹病毒DNA(DNA-polymerase gene)片段。被放大的片段會清楚的呈現在電泳凝膠上(譯者：也是electrophoresis的技術)。我們發現，除了從未受感染處所採集的對照組樣本外，其他的所有樣本都被檢測出含有龜類皰疹病毒的DNA片段。
3.病例討論
本病例中值得注意的地方有以下幾點：病龜的口腔黏膜並沒有如同點型的病症一般產生發炎的現象，在另一方面，其前肢有皮膚炎的發生。雖然在這些被病毒損害區域的皮膚樣本中都可以檢測出龜類皰疹病毒的DNA片段，不過，自未受感染處所採得的樣本在檢測時都呈陰性的反應。
我們利用偵測咽喉、尿液以及血液中龜類皰疹病毒的DNA片段，在24小時內就診斷出本例中的病龜確實是受到皰疹病毒的感染。因為病龜在採集樣本後隔天就死亡了，因此，我們沒有辦法做任何的治療。在病龜死亡後，我們將其解剖，並將其器官取出做更進一步的檢驗。檢驗的結果更加証實了我們之前的診斷。
此外，我們發現病龜的肺部含有大量的Pasteurella testudinis菌以及中度的凝血陰性(coagulase-negative)葡萄球菌。我們推測，這是二次感染的結果。這些細菌可能是趁著陸龜因冬眠及皰疹病毒感染而虛弱時入侵體內。在冬眠其間，這隻陸龜減少了15％的體重，這是他所能容忍的體重減少的上限。病龜的肺部有明顯可見的損傷，因此我們推測肺炎是造成這隻陸龜在冬眠結束後十天死亡的主因。
那隻在冬眠前和病龜養在一起的公陸龜一直都很健康。我們他在冬眠結束後的4週及十週(也就是在他和病龜最後接觸後的九個月以及病龜死亡後的二個月)分別採取那隻健康陸龜的咽喉及血液樣本進行分析。所有的樣本內都沒有檢測出抗皰疹病毒的抗體或龜類皰疹病毒的DNA片段。
我們由這些結果推測，那隻病龜在剛購入時，也就是看起來還健康的時候，還沒有開始釋放出皰疹病毒顆粒。不過，我們推測，那隻病龜在購入時就已經攜帶有皰疹病毒了，因為在此之後，除了那隻對龜類皰疹病毒檢測呈陰性反應的公陸龜外，他就沒有和其他的陸龜有過接觸。而潛伏在病龜內的皰疹病毒，直到病龜的抵抗力因冬眠而減弱時才開始活化而進行複製。幸運的是，此時，飼主就即時的將這兩隻陸龜分開飼養，因此，公陸龜並沒有受到感染。
預防
預防皰疹病毒的感染是十分重要的，因為現今並對於皰疹病毒並無任何有效的疫苗或療法。我們也無法預知皰疹病毒何時潛伏或何時活化，而飼主也無法直接的從外觀上作判斷。為了保護那些健康的個體，飼主要將任何新進的個體加入群體之前應至少將其隔離觀察一年的時間，並且至少進行兩次龜類皰疹病毒抗體的檢測。我們在得到新的個體後應立即做第一次的血液抗體檢測，而在陸龜冬眠後應進行第二次的檢測。
因為抗體檢測的準確度並非100％，因此我們也應從咽喉採樣以用PCR來偵測龜類皰疹病毒DNA片段的存在，或者，我們也可以進行其他血清學及病毒學的分析來增加診斷的準確性。
因為不同種類的陸龜對於皰疹病毒的敏感程度不同，因此，我們應該將不同種類的陸龜分開飼養。而我們也應該避免將某一飼育箱內的物品拿至另一飼育箱內使用(譯者：如果一定要這麼做，可以先利用漂白水消毒)。
如果陸龜在取得後的兩年內生病，我們必需考慮其被皰疹病毒感染的可能性，且立刻將他隔離飼養。在這種情況下，我們最好能在24小時內採取病龜咽喉部位的樣本，並利用PCR來檢測龜類皰疹病毒DNA片段的存在。
隨著德國境內爬蟲飼育風氣的興起，以及爬蟲交易市場的增加(就算是野生採集個體的流通率下降而人工繁殖個體的流通率上昇)，我們最好在得到新的個體後能幫他們做健康檢查，尤其是在將他們和其他個體一起混養之前。如果你得到一隻新的陸龜(就算他看起來非常健康)，你也應該帶他到獸醫那進行PCR和血清學的檢測，以排除感染皰疹病毒的可能性。而販賣者在將你的陸龜出售前也應該確認你的陸龜沒有感染皰疹病毒，這不但可以避免買家日後發生問題，也有助於維持賣家量好的名聲。
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發表於 2024-10-10 16:37:41